适体修饰纳米金催化共振散射光谱检测凝血酶原理
凝血酶是一种重要的蛋白酶, 在血液凝固、炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥重要作用, 其含量是衡量凝血机制的重要指标. 因此, 它的检测具有重要意义. 测定凝血酶主要有发色底物法, 敏感度为2.00～10.0 U/mL, 但由于发色底物试剂过于昂贵, 操作条件要求较高, 检品浊度或颜色也易产生干扰, 使其应用受到限制.
近年来, 廖共山等采用纤维蛋白原平板法测定凝血酶, 检测范围为0.150～5.00 U/mL; 徒永华等用荧光法可测定2.6×10－3～0.460 U/mL凝血酶, 检出限为1.20×10－3U/mL; 江波等采用共振散射光谱法测定了0.190～0.390U/mL凝血酶,其检出限为9.00×10－2U/mL. 但这些方法灵敏度欠佳. 郑静等利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增, 建立了测定8.59×10－2～2.58×10－5U/mL凝血酶的电化学传感器, 检测限为5.20×10－7U/mL, 方法灵敏, 但过程较长. 核酸适体(Aptamer)是通过SELEX技术筛选出来的, 可以特异性结合目标分子的核酸序列片断. 核酸适体和蛋白质等目标分子的结合与抗体和抗原结合相类似, 具有很强的专一性和选择性. 基于核酸适体识别不同疾病基因蛋白质分子的蛋白质传感器的研究和发展相应的诊断技术受到人们极大的关注. 目前已有基于核酸适体检测蛋白质的比色法、荧光法、晶体石英微天平法、电化学法等报道.
纳米金具有共振散射效应特性, 李正平等利用巯基化DNA短序列功能化金纳米颗粒, 通过与目标DNA序列互补杂交实现了纳米金聚集组装, 通过测定共振光散射信号实现了对特定序列DNA的快速检测. 纳米金也具有很强的催化活性, 以纳米金作为晶种催化剂而建立的金/银增强技术已用于测定DNA.
广西师范大学环境与资源学院蒋治良等人用核酸适体修饰纳米金制备了识别凝血酶(TB)的适体修饰纳米金(AptAu)共振散射光谱探针. 在pH7.40的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中及NaCl, KCl存在下, AptAu探针中的适配体特异识别凝血酶, 生成稳定的G-四分体和大粒径的纳米金聚集体. 经微孔滤膜过滤后, 纳米金聚集体被分离, 以滤液中未反应的AptAu作催化晶种, 在20.0μg/mLHAuCl4-5.01mmol/L HCl-1.83mg/mLCTMAB-50.1μg/mLVC条件下, 催化维生素C(VC)还原HAuCl4生成较大粒径的金颗粒, 体系在600 nm处有一共振散射峰. 随着凝血酶浓度的增大, 滤液中AptAu浓度降低, 催化作用减弱, 600 nm处的共振散射峰降低, 其降低值ΔI600 nm与凝血酶浓度在6.40×10－3～0.150/mL范围内存在良好线性关系, 回归方程为ΔI＝1.26×103C＋1.50, 相关系数为0.999, 检出限为1.30×10－3U/mL. 该法用于定量分析人血浆中凝血酶, 结果满意.