基于金纳米粒子低成本灵敏检测磷酸酶
目前常用的磷酸酶检测技术主要包括抗体法(如免疫印迹和酶联反应等)和底物法(水解后的底物带有荧光或紫外吸收). 例如, 在磷酸酶作用下, 底物硝基苯酚磷酸酯可被转化成硝基苯酚, 后者在405 nm 处有着强烈的紫外吸收; 通过检测该处的紫外吸收值, 可实现对磷酸酶的定量检测. 然而, 这些传统方法存在如下不足: 一、成本高, 抗体等蛋白试剂通常较为昂贵且容易失活; 二、无法即时、快速检测, 传统检测方法通常需要如紫外-可见和荧光光谱仪等大型仪器设备来协助分析, 且需要专业人员进行操作. 最近, 一种基于金属(如金和银等)纳米粒子的“肉眼”检测技术引起了广泛的关注, 并有望为上述不足提供解决方案. 该技术的设计思想为, 利用金属纳米粒子特有的表面等离子共振性质, 将金属纳米粒子设计成稳定性受磷酸酶调控的体系, 如磷酸酶能够破坏或重建纳米粒子在溶液中的稳定性, 进而引起金属纳米粒子的聚集或重新分散, 同时伴随着溶液宏观颜色的变化. 通过“肉眼”观察这种溶液的颜色变化, 可方便地对样品中磷酸酶的含量及活性进行评估. Choi等设计了一种磷酸酶响应的“电荷反转型”金纳米粒子, 即在磷酸酶作用下, 部分金纳米粒子的表面电荷发生反转(负电荷变为正电荷), 导致该部分金纳米粒子与溶液中带相反电荷的粒子发生聚集, 同时伴随着溶液颜色的变化. 类似地, Li等构建了以三磷酸腺苷(ATP)为基础的磷酸酶检测手段, 即在磷酸酶作用下, 银纳米粒子的稳定基团ATP 被转化为二磷酸腺苷(ADP); 由于ADP不足以稳定银纳米粒子, 从而导致银纳米粒子聚集以及溶液颜色的变化. 需要指出的是, 文献中报道的方法大多采用多肽、核酸、ATP 或抗坏血酸等生物分子构建磷酸酶检测体系, 由于这些生物分子的化学结构不稳定( 如ATP易分解为ADP, 而抗坏血酸易被氧化为脱氢抗坏血酸), 且多肽和核酸等分子可被其他生物酶类如蛋白酶或核酸酶等降解, 导致这些方法在实际生物样品的测试中存在局限性.
复旦大学高分子科学系陈道勇等人合成了一种化学结构稳定的水溶性寡聚(4-乙烯基苯基磷酸)[oligo(4-vinyl-phenylphosphate), OVPP], 并制备得到由OVPP 稳定的磷酸酶响应型金纳米粒子Au@OVPP,最后以酸性磷酸酶为例, 考察了Au@OVPP 在磷酸酶可视化检测方面的应用. 由于OVPP的亲水性, Au@OVPP 可在水溶液中稳定分散; 当体系中存在磷酸酶时, 由于OVPP中的亲水基团(磷酸根)被磷酸酶水解释放, 使得Au@OVPP 的稳定分子OVPP 由亲水变为疏水, 进而导致金纳米粒子的聚集及溶液宏观颜色的改变. 通过(肉眼)观察Au@OVPP 溶液的变色及程度, 建立了一种灵敏、专一和低成本的磷酸酶检测方法. 该方法对于酸性磷酸酶的(肉眼)检测下限约为10 U/mL, 且对多种生物分子具有较好的抗干扰能力.