大肠杆菌(A)和肠致病性埃希氏菌(B)与金纳米粒子的结合TEM图
大肠杆菌O157：H7( E. coli O157：H7)是肠出血性大肠埃希氏杆菌的一个主要菌型, 受其污染的牛肉、牛奶、鸡肉、蔬菜及果饮料等均可成为传播媒介. 人感染E. coliO157：H7后, 轻者会出现短暂腹泻、恶心及呕吐等症状, 重者则导致剧烈腹痛、出血性结肠炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合症等. 因此, 对E. coli O157：H7进行快速、灵敏、实时检测具有重要的应用价值.
传统的微生物培养法、生物发光法及细胞计数法等的检测时间长(一般为1~3d)且灵敏度低, 不能完全满足E. coli O157：H7的检测要求. 近年来, 分子生物学、免疫学及生物传感器等技术被用于E. coli O157：H7的检测与鉴定. 巢强国等利用聚合酶链式反应(PCR)法检测食品中的E. coli O157：H7, 其检出限可达2.0cfu/mL. Yu等通过时光分辨荧光免疫分析, 采用三明治法检测了苹果酒中的E.coli O157：H7, 将单克隆抗体连接在免疫磁珠上作为捕获抗体, 以铕标记的同一抗体作为检测抗体, 可在6h内检出10 ~ 100 cfu/mL 的细菌. Li等利用化学发光磁酶免疫法对E.coli O157：H7进行了检测, 将兔抗E. coli O157：H7修饰的磁性纳米颗粒充分结合E. coli O157：H7后, 与鼠抗E. coli O157：H7的单克隆抗体结合, 然后采用碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG与上述复合物结合, 再加入碱性磷酸酶的特异性底物进行E. coli O157：H7的检测, 该方法检出限为103cells/mL,完整的检测时间约为3 h.Xu等应用电化学传感器, 分别采用羧基化多壁碳纳米管、戊二醛及3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰的电极检测E. coli O157：H7, 结果显示戊二醛修饰的电极的电信号最强, 在1.0×103 ~1.0×107cells/mL范围内呈线性关系, 检出限为8.0×102cells/mL.
免疫生物传感器是一种特异性强、快速且简便的检测技术, 已广泛应用于微生物的检测. 尤其是表面等离子体子共振(SPR)技术不同于其它传感技术, 其具有无需标记、实时监测、操作简单及灵敏度高等优点, 已被广泛应用于多个研究领域. 目前, 多数利用SPR生物传感器检测E. coliO157：H7的研究是基于生物素-亲和素系统放大原理. 王凯等通过亲和素-生物素系统放大响应信号, 并引入复合抗体作为二抗, 应用SPR传感器对E. coli O157：H7进行检测, 其检出限达到105cfu/mL, 并建立了细菌浓度与折射率对应的标准曲线, 整个检测过程可在1 h内完成. Wang等利用SPR建立消减抑制反应法检测E. coli O157：H7, 其检出限为3.0×104cfu / mL. 他们又引入生物凝集素作为受体进行检测, 检出限下降至3.0×103cfu/ L.
金纳米粒子(AuNPs)因其折射率大、易于标记且用量少等优点成为增强SPR响应信号的有效方法. 目前, AuNPs已成功地应用于酶、DNA和抗体等各种生物分子的标记.
湖南农业大学食品科技学院刘霞等人将金纳米粒子(AuNPs)标记的大肠杆菌O157：H7(E. coliO157：H7)的多克隆抗体 ( PAb)作为二抗,采用氨基偶联法将PAb固定在传感器表面作为一抗, 通过三明治方法用双通道表面等离子体子共振(SPR)传感器对E. coli O157：H7进行检测, 并与SPR直接法检测进行了比较. 结果表明, 直接法的检出限为103cfu/mL, 线性范围为103~109cfu/mL; AuNPs增强三明治法的检出限为10cfu/mL, 线性范围为10 ~1010cfu/mL, 灵敏度比直接法提高了100倍, 且具有更宽的检测范围. 该方法不仅检测时间短, 而且具有良好的选择性和重现性.