免疫纳米金催化葡萄糖-铜(II)微粒反应原理图
铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,简称CP)是一种由肝脏合成的糖蛋白, 也是人类及脊椎动物体内的唯一的多铜氧化酶, 它对多酚及多胺类底物有催化氧化能力. CP属于一种急性时相反应蛋白, 在许多疾病如创伤和肿瘤的临床诊断监测上应用很广, 它是协助诊断Wilson病的重要指标. 因此测定其含量对某些疾病的诊断与鉴別有重要意义. 目前, CP 的检测方法主要有酶催化法和免疫法如酶催化比色法、免疫比浊法、免疫电扩散法(EIA,即火箭电泳法)、动力学比浊法、放射免疫扩散法(RID)等, 但尚未见测定CP的免疫纳米金催化共振散射光谱法报道.
纳米金具有生物相容性好、光学和电学性质奇异、催化活性高等特点, 已用于蛋白质和核酸标记、生化分析等. 以纳米金作晶种催化剂而建立的金/银增强技术已用于测定DNA.Xu等报道了一个匀相免疫纳米金银加强光散射测定核酸的新方法, 其检测限达到10fmol/L.免疫纳米金催化银染色法已用于光镜和电镜水平的免疫组织化学研究及生化分析. 免疫纳米金催化银增强法的灵敏度较高, 但这种方法的缺点是样品中的Cl－与增强液中的Ag＋发生沉淀对分析结果有较大的影响. Hainfeld建立的金增强法, 大大地提高了检测信号并且克服了银增强法的一些不足. Yi等报道了应用纳米金催化NADH/HAuCl4反应得到大粒径胶体金机理, 建立了检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的光学传感器. 蒋治良等基于免疫纳米金催 化HAuCl4与NH2OH•HCl反应, 建立了选择性测定补体3的免疫纳米金催化共振散射光谱法. 上述金增强反应一般在常温下进行, 反应较难终止, 且贵金属试剂价格较高. 因此, 研究试剂价廉易得、反应易控制、选择性的纳米催化分析体系具有重要意义.
共振散射光谱法具有简便、快速、灵敏等特点. 在提高共振散射光谱法选择性方面,将高选择性的金标免疫反应与共振散射光谱结合检测血清中的免疫蛋白,以及将无机催化反应和酶催化反应与共振散射光谱检测技术结合用于无机物和有机物分析, 均取得了较好的效果. 但纳米金标免疫反应与葡萄糖-斐林试剂催化反应耦联及其用于铜蓝蛋白共振散射光谱分析的研究尚未见报道.
广西师范大学环境与资源学院梁爱惠等人用15 nm的纳米金标记羊抗人铜蓝蛋白抗体(GCP)可获得铜蓝蛋白(CP)纳米金探针(AuGCP). 在pH 7.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中, CP与AuGCP发生特异性结合生成胶体金免疫复合物. 离心分离后, 离心液中的AuGCP可作为酒石酸铜(C4H4O6Cu)-葡萄糖反应体系的催化剂, 生成的Cu2O微粒在620 nm处有一共振散射峰. 在选定条件下, 620 nm 处共振散射信号降低值△I620 nm与铜蓝蛋白浓度 cCP在 0.18～45ng/mL范围内存在良好线性关系, 回归方程为ΔI 620 nm ＝2.27cCP＋5.05, 相关系数为 0.9940, 检出限为 0.14 ng/mL. 该法用于人血清中铜蓝蛋白的检测, 结果满意.