(A) 多重胶体金标记树枝状复合物的制备及相应的TEM表征图; (B) 金增强多重胶体金标记放大的电化学溶出伏安免疫分析示意图
开发简单、灵敏、有效的蛋白质检测新技术在临床疾病诊断、新药开发、生化防御等领域意义重大. 特别是生物体液样品中的痕量肿瘤标志物的定量测定有助于癌症的早期诊断和治疗. 在过去的20年中, 电化学免疫分析技术以样品用量少、灵敏度高、使用仪器价格低廉等突出优点发展迅猛. 此外, 该技术易于集成化, 可用于开发低能耗的便携式分析装置, 以满足日益增长的即时检验和现场分析的需求. 近年来, 由于胶体金具有独特的理化性质, 如高的电子密度、大的比表面积、良好的生物相容性等, 使其在生化分析研究中得到广泛应用. Dequaire等首次利用金纳米颗粒可被强酸氧化溶解成金离子的性质, 报道了一种基于胶体金标记物的电化学溶出伏安免疫分析新方法, 其用于羊IgG抗原模型分析物测定时的检测下限可低至pmol/L级. 随后, 分析工作者通过采用银、金或铜增强试剂以催化胶体金增大的信号放大途径, 可将该方法的检测下限降低1～3个数量级. 尽管如此, 开发多重胶体金标记物结合金属增强技术的多级信号放大新策略, 以进一步提高电化学免疫分析方法的测定灵敏度, 降低其检测下限, 仍是一件具有重要意义的工作.
最近, Chu等制备了金标蛋白A结合金标抗体的树枝状复合物信号放大探针, 利用多重胶体金标记物的质量效应, 成功发展了一种新的高灵敏度压电免疫传感器. 受此启发, 湖南化工职业技术学院应用化学系王潇蕤等人首次通过以负载了多重胶体金标记的树枝状复合物为一级信号放大, 进而引入金增强技术以实现二级信号放大, 提出了一种基于两级信号放大策略的电化学溶出免疫分析新方法,用于痕量(amol/L级)蛋白质的高灵敏检测. 新方法的分析原理和步骤如图所示. 首先, 抗体修饰的免疫磁颗粒在近似于均相的悬浮溶液中识别、捕获样品中的分析物抗原(a),进而依次结合金标抗体(b)和金标蛋白A与金标抗体形成的树枝状复合物(c). 随后, 使用金增强试剂以增大负载于免疫复合物上的多重胶体金标记(d). 最后,使用强酸将金颗粒氧化溶解, 并采用方波溶出伏安(SWSV)法定量分析被释放的金离子(e).
结果表明, 在优化的实验条件下, 开发的新方法在用于人IgG模型分析物测定时的检测下限可低至5.2 fg•mL－1或34.7 amol/L (S/N＝3). 这种基于胶体金的金属免疫分析新技术有望用于临床诊断、环境监测、生化防预等诸多领域中目标蛋白质的高灵敏检测.