发卡型金纳米分子信标合成及检测原理示意图
JAK-STAT信号转导通路(JAK-STATsignaling pathway)是与肿瘤发生发展关系最为密切的一类信号转导通路, 在研究肿瘤分子靶向治疗、筛选分子药物靶标等方面具有重要意义. 该通路由许多细胞因子和受体所激活, 这些激活因子与细胞膜上受体相结合, 使受体二聚化或多聚化. 受体内源性酪氨酸蛋白激酶(proteintyrosine kinase, PTK)与相偶联的胞浆可溶性PTK迅速磷酸化,形成信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators oftranscription, STATs)结合位点. 最后,STATs通过SH2功能区与受体胞浆区结合后被激酶酪氨酸磷酸化, 离开受体,形成二聚体并入核, 进而结合于特定的DNA启动子序列,启动基因表达, 调节细胞的分化、增生和凋亡.
正常细胞中的STATs的磷酸化是短暂的, 而肿瘤细胞自分泌或旁分泌的细胞因子以及基因改变所致的持续活化的酶类可致PTK的持续激活, 从而使STATs呈现持续磷酸化.人类多种原发肿瘤和肿瘤细胞系都与JAK-STAT通路的异常表达和活化有重要关系. 在此信号转导通路上, STATs蛋白家族是最重要的一类信号转导因子. 迄今, 研究人员在哺乳动物中发现了7个STAT家族成员(Stat1~4,Stat5a, Stat5b和Stat6). 它们普遍存在于多种肿瘤细胞系和原发肿瘤中, 通过JAK-STAT途径被活化从而参与肿瘤细胞的异常增殖、分化和血管生成等过程.
在多种肿瘤细胞系和多种转化细胞系中(尤其是白血病和乳腺癌),人类编码信号转导及转录活化因子5(signal transducer and activator of transcription5, STAT5)是STAT家族中与肿瘤最密切相关的成员. 持续活化的STAT5增强了细胞的转化,同时也阻断了细胞的凋亡.
STAT5的基因定位于人类第17号染色体上,大鼠的位于10号染色体上, 小鼠的位于11号染色体.STAT蛋白主要由STAT5a和STAT5b两种亚型构成.这两种亚型96%以上是同源的, 它们能被许多细胞因子所激活. 研究发现, STAT5a单基因敲除小鼠表现出泌乳素依赖性的乳腺发育障碍; STAT5b单基因敲除小鼠则出现与生长激素受体缺陷小鼠相似的基因缺陷. STAT5b作为信号转导及转录激活因子中的一个成员, 受许多细胞因子、激素、生长因子的调控. 其作用方式主要有两种:(1) STAT5b在被受体激活后形成二聚体, 转移至细胞核, 结合于靶基因的启动子部位,参与靶基因转录的正调控或负调控. (2) STAT5b激活后,通过调节下游信号转导, 从而调控细胞增殖、分化、凋亡等生命活动.
STAT5b存在于未经刺激的细胞胞浆内, 可在多种细胞因子和生长因子的刺激下发生酪氨酸磷酸化而活化. 近几年的研究已证实, STAT5b的异常活化与多种恶性肿瘤的发生发展有密切关系, 包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、肝癌、鼻咽癌、白血病等. 例如, Spiekermann等人研究发现, 95%的急性髓系白血病原始幼稚细胞中STAT5b活性升高; Birkenkamp等人则认为STAT5b的活化会上调酪蛋白启动子的活性, 使淋巴细胞发生恶性转化; 夏国良等人发现头部肿瘤中存在着STAT5b的持续或异常激活, 并且与肿瘤的转移也有一定的关系. 因此, 通过检测STAT5b的活化水平, 对于进一步阐明肿瘤的发病机制、深入了解肿瘤的发展状况以及寻求新的肿瘤治疗途径均具有重要意义.
目前对细胞内STATs蛋白的检测多用流式细胞术(flow cytometry,FCM), 也有用Western Blot检测STAT蛋白的报道. 但是Western Blot样本的预处理步骤复杂、费时, 对样本和试剂的消耗量大. 同时, Western Blot的结果由于条件所限, 几乎只能做定性分析, 而无法实现定量分析. 而运用流式细胞术进行蛋白含量检测最大的缺点在于极易出现假阳性结果. 同时, 洗涤剂对细胞的破坏、标记时间长、操作步骤多, 也是流式细胞术的限制因素.
中国药科大学生命科学与技术学院生物医学工程教研室顾月清等人优化STAT5b mRNA序列并合成出一种新型STAT5b金纳米荧光分子信标.该信标由发卡型STAT5b mRNA特异性序列、FITC荧光染料、金纳米粒三部分组成. 通过激光共聚焦和流式细胞术等实验方法,实现该信标对HepG-2细胞和PC12细胞中STAT5bmRNA的实时检测. 最后, 运用RT-PCR方法,该分子信标检测STAT5b mRNA的可靠性得到验证. 基于本研究实验结果,可推断该新型金纳米荧光分子信标有望进行JAK-STAT信号通路中其他转录因子的检测.