具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备
金纳米团簇(AuNCs)是由几个至几十个Au原子组成的具荧光的分子级聚集体。其粒径一般小于2 nm，介于原子与纳米颗粒之间。金纳米团簇特有的量子尺寸效应使其光学性质具有随粒径大小而变化的特性，这种特性使其荧光发射光谱从可见光到近红外光区范围内可调谐。由于贵金属具有化学惰性且生物相容性好，使得荧光金纳米团簇具有一系列引人注目的特性，包括超小的尺寸、毒副作用小和良好的生物相容性、斯托克斯位移(Stockes shift)较大以及出色的光稳定性,从而成为生物传感与成像的理想突光探针。对于金纳米团簇，自身具有荧光，对金纳米团簇的表面进行功能化，能够具有检测的靶向性。随着对肿瘤分子水平研究的不断深入，在肿瘤细胞表面发现一系列受体，这些受体在肿瘤组织中过度表达，但是在正常细胞中高度保守，特异性配体或抗体可以和这些受体进行结合，并被细胞内化进入到细胞内部。这些肿瘤特异性的受体为肿瘤检测及治疗提供了靶点。自从发现叶酸受体在绝大多数恶性肿瘤细胞中高度表达，而在正常细胞高度保守以来，叶酸/叶酸受体介导靶向传递成为该领域研究的热点。基于金簇纳米粒子具有荧光性能，且对其表面进行进行叶酸功能化，制备出具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇。
本文的目的在于提供一种具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法，所述的具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇是由叶酸和发荧光的金簇通过点击化学偶联所制备。具体技术方案如下：
1)将氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液混合搅拌，得到发荧光的金簇纳米粒子；
2)将11-巯基十一烷酸和叠氮十一烷基硫醇加入到上述溶液中，放置、纯化；
3)向2)中加入炔基化叶酸，炔基化叶酸溶于1:1的水和二甲基亚砜混合溶液中；
4)向3)中加入CuSO4和抗坏血酸催化下通过点击化学连接叠氮十一烷基硫醇和炔基化叶酸，实现叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备；
5)叶酸受 体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育；
6)对叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育前后荧光强度的测定。
具体实施条件：在步骤I)中，所述氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液的体积比为10:10:1 ;所述氯金酸溶液浓度为0.25臟01/1，所述柠檬酸三钠溶液浓度为0.25 mmol/L，所述的硼氢化钠溶液浓度为0.01 mol/L，所述的搅拌时间为30 S。在步骤2)中，所述的ll-巯基^^一烷酸的浓度为100 mmol/L，所述的叠氮十一烷基硫醇10 mmol/L，所述的溶液在25°C下放置48小时，所述纯化采用分子量10 kDa的半透膜进行透析60 min。在步骤3)中，所述炔基化叶酸的制备过程是1.0 g叶酸溶入10 mL 二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和0.44 g 1_(3_ 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌24 h，接着加入100 mL蒸馏水，搅拌40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸。[0009] 在步骤4)中，所述的CuSO4和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L。在步骤5)中，所述叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与K 562细胞孵育时间30min。在步骤6)中，所述对叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育前后溶液在激发波长和发射波长分别为470 nm和650 nm下进行测定。
本文所述一种叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子能够特异性识别表面有高水平叶酸受体表达的细胞，可作为检测肿瘤细胞的分子探针，在肿瘤细胞检测中具有重要的应用价值。